Pepsin, asidik ortamda en iyi şekilde çalışır. pH aralığı 1,5-2,5 civarında olan mide asidik ortamında en yüksek aktiviteyi gösterir. pH düzeyi 5'ten yüksek olduğunda pepsinin proteolitik etkisi hemen hemen hiç kalmaz ve kısa sürede inaktif hale gelir. Pepsin, mide asidinin etkisiyle aktif hale gelir ve proteinleri daha küçük parçalara ayırarak sindirimin ilk aşamasını başlatır.