Yapay zekadan makale özeti
- Kısa
- Ayrıntılı
- Bu video, bir eğitimci tarafından sunulan protein izolasyonu ve saflaştırma teknikleri hakkında kapsamlı bir eğitim içeriğidir. Konuşmacı, doktora ders döneminden kalan slaytlarını kullanarak ve laboratuvar deneyimlerini paylaşarak konuyu anlatmaktadır.
- Video, proteinlerin tanımı ve özellikleriyle başlayıp, protein izolasyonu için gerekli aletler ve materyalleri anlatmaktadır. Ardından homojenizasyon, tampon kullanımı, protein değişimini artırma yöntemleri, çöktürme teknikleri, diyaliz, leofilizasyon ve kromatografi gibi saflaştırma yöntemleri detaylı olarak açıklanmaktadır. Ayrıca protein aktivitesinin ölçümü, absorbans ölçümü ve protein görüntüleme teknikleri (Western blot) hakkında bilgiler verilmektedir.
- Video, proteinlerin hücre içi, hücre zarı ve hücre dışı olarak nasıl izole edilebileceğini, farklı santrifüjleme aşamalarında hangi organellerin çökeceğini görsel örneklerle göstermekte ve protein saflaştırma sürecini adım adım anlatmaktadır. Laboratuvar ortamında bu teknikleri uygulamak isteyenler için faydalı bir kaynak niteliğindedir.
- Protein İzolasyonu Hakkında Genel Bilgiler
- Konuşmacı, doktora ders döneminden kalan protein izolasyonu videosunu paylaşacağını belirtiyor.
- Protein, Yunanca "prota" sözcüğünden gelen, "birincil öneme sahip" anlamına gelen bir kelimedir.
- Proteinler, aminoasit zincirlerinin birleşmiş halleridir ve taşıyıcı RNA'nın her bir kodundan elde edilen aminoasitlerin birleşmesiyle oluşur.
- 01:46İzole Edilebilecek Protein Türleri
- Enzimler, hücre zarındaki proteinler, reseptörler, antikorlar ve büyüme faktörleri gibi çeşitli proteinler izole edilebilir.
- Her protein türü için farklı izolasyon prosedürleri vardır.
- Mikroorganizmalar enzimleri hücre dışına salgılayabilir, hücre içinde tutabilir veya hücre zarındaki perioplazmik bölgede saklayabilir.
- 03:02Protein İzolasyonu İçin Gerekli Araçlar
- Protein izolasyonu için terazi, pH metre, manyetik karıştırıcı, buz makinesi, homojenizatör gibi aletler gereklidir.
- Hücre içi ve hücre zarı izolasyonu için santrifüjler, kromatografi sistemleri, spektrofotometre ve liflizatör gibi aletler kullanılır.
- Liflizatör, soğukta dondurarak kurutan bir araçtır ve diyaliz tüpleri, tampon çözeltiler gibi materyallere ihtiyaç vardır.
- 03:44Protein Özütünün Hazırlanması
- Protein özütü, homojenizasyon aşamasından sonra elde edilen sıvıdır.
- Protein özütü, hayvanlardan (kan, organ, doku), küçük canlılardan (kurtçuklar, sinekler, böcekler), hayvan hücre kültüründen, bitkilerden (kök, gövde, yaprak, çiçek) ve mikroorganizmalardan hazırlanabilir.
- Protein ekstraksiyonu, mikroorganizmalar üzerinden anlatılacaktır.
- 06:14Homojenizasyon İşlemi
- Hücre içi veya hücre zarındaki proteinleri elde etmek için homojenizasyon gereklidir.
- Homojenizasyon için telefon başlıklı, ultrasonik veya bıçakla homojenizatörler kullanılabilir.
- Mikroorganizmalar için ultrasonik homojenizatör yeterlidir ve işlem sırasında hücrelerin parçalanıp parçalanmadığına mikroskop altında bakılmalıdır.
- 08:21Homojenizasyon Sürecinde Dikkat Edilmesi Gerekenler
- Homojenizasyon işlemi hücre çeper engelini aşmaktır.
- Isıya duyarlı proteinler için işlem buzda yapılmalıdır.
- Proteazlar ortaya çıkarsa, fen, sülfon, florür gibi proteaz inhibitörleri kullanılmalıdır.
- 09:38Kademeli Santrifüjleme
- Homojenizasyon sonrası kademeli santrifüjleme ile kısmi saflaştırma yapılır.
- İlk aşamada 962 rpm'de 10 dakika santrifüjleme yapıldığında, pelette plazma membranı ve nükleer kalır, süperde sitoplazma içeriği kalır.
- İkinci aşamada 25.000 rpm'de 10 dakika santrifüjleme yapıldığında, pelette mitokondri ve lizozomlar kalır, süperde sitoplazma içeriği kalır.
- 12:59Daha Fazla Santrifüjleme Aşamaları
- Üçüncü aşamada 34.000 rpm'de 30 dakika santrifüjleme yapıldığında, pelette gol kompleksi kalır, süperde endoplazmik retikulum ve sitoplazma içeriği kalır.
- Dördüncü aşamada 105.000 rpm'de 10 dakika santrifüjleme yapıldığında, endoplazmik retikulum çöker ve sadece sitoplazma içeriği kalır.
- Bu ultra santrifüj makineleri ile yapılan işlem kolay değildir ve her makine bu gücü ulaşamaz.
- 14:06Homojenizasyon ve Protein Kararlılığı
- Homojenizasyonda en çok kullanılan tamponlar fosfat ve triatsa tamponlarıdır.
- Protein kararlılığını artırmak için etta iki mert merkaplı etanol ve sistemi kullanılabilir.
- Homojenizasyon sonrasında oluşan yağ tabakası cam yünü ile sürebilir ve alttaki süper alarak hücre içi protein elde edilebilir.
- 15:10Protein Saflaştırma ve Aktivitesi
- Saflaştırma prosedürüne yüzde yüzlük enzim aktivitesi olan bir enzim koyulduğunda, saf enzim elde edilir ancak aktivitesi yüzde otuz'a kadar düşer.
- Protein değişimini artırmak için kuru polimer (sefadex) kullanılabilir.
- Sefadex kolonları iki porlu yapıya sahip olup, tanecik boyutları farklı olan matrix setleri (G25, G50, G75, G100) protein boyutlarını belirler.
- 17:25Saflaştırma Aşamaları
- Protein değişimini artırmak için ultra filtrasyon, diyaliz, leofilizasyon ve çöktürme aşamaları kullanılır.
- Homojenizasyon ve kademeli santimde alınan süper, çöktürme aşamasına gönderilir.
- Çöktürme işlemi amonyum sülfat gibi tuzlarla yapılır; tuz suya bağlanarak proteinden su ayrılır ve proteinler çöker.
- 20:35Çöktürme Tablosu ve Tuz Çözeltileri
- Çöktürme tablosu molekül ağırlığına göre hazırlanmış, 0-100 ml çözeltiye göre ve 000°C'de yapılan işleme göre hazırlanmıştır.
- Proteininize göre amonyum sülfat çözeltisi derişimi (20%, 30%, 40%, 50%, 60% vb.) seçilebilir.
- Tuz çözeltileri hazırlarken, mevcut çözeltiye gerekli miktarda tuz eklenerek istenen derişime ulaşılır.
- 24:15Protein Saflaştırma ve Görüntüleme
- Protein saflaştırma işlemi için laboratuvarda kolonlar, toplayıcı kolektör ve UV okuyucu kullanılır.
- Ion exchange kromatografisi ile kademeli tuz konsantrasyonu verilerek kolondaki protein geçirilir.
- Protein izolasyonu ve saflaştırma sonrası, western blot yöntemiyle proteinler görüntülenir ve antijen-antikor ilişkisi ile antijen izi görünür hale getirilebilir.