Yapay zekadan makale özeti
- Kısa
- Ayrıntılı
- Bu video, bir konuşmacının genetik mühendislik laboratuvarında kullanılan teknikleri anlattığı kapsamlı bir eğitim içeriğidir.
- Video, plazmit seçimi ve doğrulama sürecinden başlayarak, koloni seçimi, gliserol stoğu hazırlama, mini prep prosedürü ve DNA konsantrasyonu ölçümü gibi temel adımları göstermektedir. Daha sonra DNA enzim kesimi teknikleri, gerekli araçların tanıtımı, enzim seçimi ve reaksiyon hazırlama aşamaları detaylı olarak anlatılmaktadır.
- Eğitim içeriğinde ayrıca enzim reaksiyonunda dikkat edilmesi gereken noktalar (buz kullanımı, eldiven giymenin önemi, doğru pipetleme teknikleri), reaksiyonun nasıl durdurulacağı, jel yüklenmesi ve sonuçların nasıl yorumlanacağı gibi pratik bilgiler de sunulmaktadır. Video, DNA dizileme ve blast analizi gibi sonraki aşamaların da kısaca bahsedilmesiyle sonlanmaktadır.
- 00:02Laboratuvar Malzemeleri ve Koloni Seçimi
- Radler plating beats plate'ler kullanılıyor, üzerine dökülüp çalkalandıktan sonra steril etmeye gerek yok ve tekrar kullanılabilir.
- JM109 bakterilerini kompeten hale getirmek için Mix Ango Ekolay Transformation Kit kullanılıyor.
- Koloni seçme aşamasında, kolonilere pipet dokunulup, her biri LB ve ampisilin içeren falcon tüplerine konuluyor.
- 02:05Bakteri Çoğaltma ve Plazmit Doğrulama
- Bakteri kültürleri 37 derece 220 rpm'de sallanarak yaklaşık 6-8 saat tutuluyor.
- Amac, plazmitin doğruluğunu kontrol etmek çünkü büyük büyüse de istenen plazmit olmayabilir.
- Çoğalmış bakterilerden gliserol stoğu alınıyor: 200 mikrolitre bakteri ve 200 mikrolitre gliserol karıştırılıp -80 dereceye atılıyor.
- 03:47Mini Prep Prosedürü
- Mini prep prosedürü için Zeymodan marka kit kullanılıyor, bu kitler pratik, kullanımı kolay ve uygun fiyatlı.
- Modif alkali metod kullanılıyor, bu metod bakterinin içinden sadece plazmiti alıyor, kromozomal DNA telef oluyor.
- Prosedürde Li-buffer ekleniyor, nötralize ediliyor, özel filtreye yükleniyor ve plazmit filtreden çıkartılıyor.
- 06:11DNA Konsantrasyonu ve Enzim Kesimi
- Mini prep sonrası elde edilen DNA solüsyonu nanodropta ölçülerek konsantrasyonu belirleniyor.
- Plazmitin türünü öğrenmek için enzim kesimi yapılıyor, 10.000 büyüklüğünde plazmit tek taraflı kesilirse linerize hale geliyor.
- Plazmitler super-coil, open circular veya lineer hale getirilmiş olabilir ve agoroz jelde farklı şekillerde yürüyor.
- 09:21Enzim Kesim Teknikleri
- Plazmiti lineer hale getirmek için tek bir yerden kesen single cutter enzimi kullanılıyor.
- Dual cutter enzimle kesildiğinde iki fragman, iki natural cutter enzimle kesildiğinde dört fragman elde ediliyor.
- Enzim seçimini plazmit haritasına bakarak yapıyoruz ve çok sayıda kesim yaparak daha emin olabiliriz.
- 13:56Enzim Kesimi İçin Kaynaklar
- Enzim kesimi için NEP adlı bir firmanın web sitesi kullanılabilir.
- NEP sitesinde plazmitin dizisini Fast formatında yükleyerek enzim kesim bölgelerini bulabilirsiniz.
- Sitede enzimlerin özellikleri ve kullanım protokolleri detaylı olarak anlatılmaktadır.
- 16:08Enzim Kesimi Protokolü
- Enzim kesimi için 37 derece sıcaklık ve Cut Smart buffer kullanılabilir.
- Protokolde 50 mikro reaksiyon kurulması, 1 mikrogram DNA, 5 mikrolitre Cut Smart buffer ve 1 mikrolitre diğer buffer'ın kullanılması gerekmektedir.
- Reaksiyon 15 dakika boyunca 37 derecede bekletilmelidir.
- 17:02Reaksiyon Hazırlama
- Reaksiyon için önce su, sonra buffer veya plazmit eklenmelidir.
- Tüp çalkalanıp quick spin yapılarak tüm malzemelerin bir araya gelmesi sağlanmalıdır.
- Enzimler en son eklenmelidir çünkü enzimlerin optimal ısısı 37 derecedir ve oda sıcaklığında sub-optimal çalışırlar.
- 19:49Enzim Kullanımında Dikkat Edilmesi Gerekenler
- Enzim kesimi işlemi buzda yapılmalıdır, enzimler ısınmamalıdır.
- Enzimlerin gliserol içinde gönderildiği için çözünük olurlar ve ısıtılmamalıdır.
- Quick spin yapmadan pipet kullanmak, enzimin gereğinden fazla kesmesine neden olabilir.
- 21:54Güvenlik ve Sonuç
- Enzim kesimi aşamasında nitril eldiven giyilmelidir çünkü ellerdeki DNA ve arenas plazmiti degrede edebilir.
- Reaksiyon 15 dakika sonra durdurulmalı ve jeli yüklemek için özel bir boya eklenmelidir.
- Jelin konsantrasyonu plazmitin büyüklüğüne göre değişir, büyük plazmitler için konsantrasyon düşürülür.
- 23:45Sonuç Kontrolü
- Jeli yüklerken boyutunu bildiğimiz bir DNA (leader) de eklenmelidir.
- Beklenen boyutlarda sonuç elde edilirse, DNA'nın sekansa gönderilmesi gerekir.
- Sekans sonuçları blast yapılarak DNA'nın istenilen DNA olup olmadığı kontrol edilir.