Desperados 3, Desperados: Wanted Dead or Alive oyununun bir ön bölümü olup, 1875 yılında geçen bir hikayeyi anlatır 12.

Oyunun konusu, John Cooper'ın, babasının katili olan ve aynı zamanda bir çete lideri olan Frank'i arayışını takip eder 12. Cooper, bu yolculukta Doktor McCoy ile tanışır ve birlikte DeVitt Şirketi'nin trenini korumak için işe alınırlar 12.

Flagstone kasabasına ulaştıklarında, Cooper, Frank'in belediye başkanının malikanesinde olduğunu öğrenir 12. Bu sırada, belediye başkanının nişanlısı Kate O'Hara, DeVitt Şirketi'nin ailesinin çiftliğini sattığını keşfeder ve belediye başkanını vurarak öldürür 12.

Cooper ve Kate, O'Hara çiftliğini DeVitt Şirketi'nin adamlarından korumak için birlikte hareket ederler ve sonunda başarılı olurlar 1. Ancak, Frank'in çetesinin diğer üyelerini kurtarmak için yaptıkları bir operasyon sırasında yakalanırlar 2.

Daha sonra, bir Vudu uygulayıcısı olan Isabelle Moreau tarafından kurtarılırlar ve birlikte Frank'in adamlarından biri olan Mareşal Wayne'i aramaya koyulurlar 12. Sonunda, Frank'in çetesinin tuttuğu insanları kurtarmak için eski bir nehir gemisini ateşe verirler ve bu, Frank'in şehri kilitlemesine neden olur 2.

Cooper, tek başına Frank ile yüzleşmek ister ve sonunda onu yenerek intikamını alır 12.