Assassin's Creed 2, 1503-1513 yılları arasında, Ezio Auditore da Firenze'nin hayatını ve Assasin Kardeşliği'nin dünya liderliği görevini anlatıyor. Ezio, babasının suikastçı olduğunu öğrenince, onun intikamını almak için tapınakçıların peşine düşüyor. Oyun, aynı zamanda Desmond Miles'ın Animus'ta Ezio'nun anılarını yaşamasıyla, geçmiş ve gelecek arasındaki bağı da işliyor.