Harley Quinn'in ilk bölümünde (1. sezonun 1. bölümü) şu olaylar gerçekleşir: Harley Quinn, Joker ile olan ilişkisini resmen bitirir ve Gotham City'nin suçlu kraliçesi olarak kendi başına yola çıkar. Poison Ivy'nin yardımıyla, Harley kötüler arasında en üst masaya oturmayı hedefler: Legion of Doom. Harley, Maxie Zeus'un Olimpiyat altın madalyalarını çalar ve bir nükleer savaş başlığı satın alarak Gotham'ı şantajla tehdit eder. Bu bölümde, Harley'in Joker'den ayrıldıktan sonra bağımsız bir şekilde suç dünyasında yer almaya çalıştığı ve Poison Ivy ile olan dostluğunun başlangıcı anlatılır.