300 Spartalı filmi, MÖ 480 yılında gerçekleşen Thermopylae Muharebesi'ni konu alır. Filmde anlatılan hikaye şu şekildedir: Sparta Kralı Leonidas, Pers Kralı Xerxes'in çok güçlü bir orduyla yaklaştığını öğrenince, cesur 300 askerini toplayarak Thermopylae'de Perslilerle savaşmaya hazırlar. Konsey savaşmama kararı alsa da askerler, şartların zorluğuna rağmen ve ölmek pahasına savaşa hazırdır. Spartalı askerlerin en büyük avantajı, kullandıkları uzun mızraklar ve güçlü kalkanlardır. Pers kral tanrı Kserxes, bölgede yaşayan bir çobandan Thermopylae geçidinin çevresinden dolanacak bir patika yolu öğrenir. Pers askerlerinin büyük bir bölümü, Spartalı askerlerin haberi bile olmadan iç bölgelere sızar. Leonidas ve diğer generaller, bazı fedakarlıklar yapmak zorunda kalır. 4 bin kişi kalmış olan birliklerinin bir kısmını Sparta iç bölgelerine gönderirler, bir kısmını ise burada savaşmak için bırakırlar. Leonidas, kalanlardan olur ve Thermopylae geçidini savunmak için bin kişilik bir birlikle kalır. Daha rahat savaşabilmek için kurdukları duvarın önüne geçerek daha da dar bir alana konuşlanırlar. Birlik, üç gün boyunca savaşır ve 20 bin Pers askerini yok eder. Film, gerçek bir hikayeyi anlatsa da, tarihsel kaynaklarda abartı ve mitolojik unsurlar bulunmaktadır.