Yapay zekadan makale özeti
- Kısa
- Ayrıntılı
- Bu video, bir firmanın temsilcisinin moleküler teknikler ve DNA izolasyonu konusunda sunduğu kapsamlı bir eğitim sunumudur. Konuşmacı, Türkiye'de faaliyet gösteren ve uluslararası ofisleri olan bir şirketin temsilcisidir.
- Video, moleküler tekniklerin temel prensiplerinden başlayarak, DNA ve RNA izolasyonu teknikleri, PCR (Polymerase Chain Reaction) metodları ve özellikle real-time PCR teknolojisinin detaylı açıklamasına odaklanmaktadır. İçerik, klinik laboratuvarlardan farklı olarak gıda laboratuvarlarında karşılaşılan izolasyon zorlukları, farklı izolasyon teknikleri (kolon tekniği, manyetik boncuk tekniği) ve laboratuvar uygulamalarında dikkat edilmesi gereken teknik detayları kapsamaktadır.
- Video ayrıca, DNA izolasyonu sonrası spektrofotometrik ölçümün güvenilirliği, CT değerlerinin önemi, farklı materyallerden (bitki bazlı ürünler, yağ, jelatin vb.) DNA izolasyonu yaparken dikkat edilmesi gereken noktalar ve laboratuvar temizliği gibi pratik bilgileri de içermektedir. Bu eğitim, laboratuvar teknisyenleri ve moleküler tekniklerde bilgi edinmek isteyenler için faydalı bir kaynak niteliğindedir.
- 00:06Firma Hakkında Genel Bilgi
- Firma klinik alanda faaliyet gösteriyor ve büyük bir kısmını ihracat olarak yapıyor, Pakistan ve İtalya'da iki tane daha ofisleri bulunuyor.
- Yüz on kişilik bir ekiple çalışarak real time PCR temelli kitle ve izolasyon sistemlerini üretiyorlar.
- Sistemler klinikte yoğun olarak kullanılırken, gıda laboratuvarları genellikle çit üzerinden çalışırlar.
- 01:08Kalite ve Dünya Sağlık Örgütü Çalışmaları
- Sistemler için kalite sertifikası gereksinimi var ve 3485 uyarınca denetlenerek faaliyet gösteriyorlar.
- Dünya Sağlık Örgütü'nün standardizasyon ve yeni testlerle ilgili çalışmaları kapsamında davet usulü olarak iki çalışma gerçekleştiriyorlar.
- Dünya pazarında klinik alanında bilinirlik kazanmış durumda.
- 02:03Moleküler Teknikler ve Real Time PCR
- Türkiye'de örneklemeden sonuca kadar izlenen silsile usulü: örnekleme, DNA rasyonu, real time PCR ile tarama analizleri ve ileri analizler şeklinde devam ediyor.
- Moleküler teknikler geniş bir alan içerir ve günümüzde mini seçin metotları, tam genom sekansı yapabilen teknikler ve dijital PCR gibi güncel metotlar kullanılıyor.
- Real time PCR, 2000'lerin başında altın standart olarak kabul edilen bir teknoloji.
- 03:29Gıda Laboratuvarlarında Moleküler Tekniklerin Zorlukları
- Araştırma laboratuvarlarında örnekler homojen yapıya sahipken, gıda laboratuvarlarında örnekler karmaşık ve heterojen yapıya sahip.
- Gıda materyallerinde ekstradan sentetik, organik olmayan kimyasallar (kıvam arttırıcılar, düzenleyiciler, stabilizatörler) bulunması işlemi zorlaştırıyor.
- İlk aşamadan itibaren örneklemenin zorluğu, DNA izolasyonunun karmaşıklaşması gibi zorluklar yaşanıyor.
- 05:51DNA ve RNA İzolasyonu Temel Aşamaları
- DNA veya RNA izolasyonu, dokunun içerisindeki genetik materyalin serbest bırakılması işlemidir.
- İzolasyon işlemi üç temel aşamadan oluşur: hücreyi parçalamak, hücre içi asitleri ayırmak ve proteinler, sekonder metabolitler gibi kalıntıları yıkamak.
- Hücreyi parçalamak için sonikasyon veya deterjan/tuzlar gibi kimyasal ajanlar kullanılır.
- 07:49Nükleik Asit Kazanımı Yöntemleri
- Proteinler ve sekonder metabolitlerin çökmesi için alkol bazlı ajanlar kullanılır.
- DNA ve RNA, belirli koşullarda cam, selüloz ve silika yüzeylere statik şarjdan kaynaklanan yapışma eğilimi gösterir.
- Rutin kitlerde genellikle silika kullanılır çünkü kolay kullanım, yüksek sıvı geçirgenliği ve tutuculuğu sayesinde tercih edilir.
- 09:50İzolasyon Teknikleri
- Manyetik boncuk tekniği ve kolon tekniği iki farklı izolasyon yöntemidir.
- Kolon tekniğinde, silika kaplı bir filtre kullanılarak nükleik asit tutulur ve sıvı süzülür.
- Manyetik boncuk tekniğinde, demir partiküllerin üzerine silika uygulanır ve bu boncuklar sıvı içinde yüzerek genetik materyali toplar.
- 11:15Otomatik Sistemlerde Kullanılan Yöntemler
- Manyetik boncuklar otomatik cihazlarda tercih edilir çünkü makine tarafından işlenmesi daha kolaydır.
- Kolon kullanırken el ile sürekli müdahale gerekirken, boncuk sistemlerinde sıvı aktarımı yoktur.
- Boncuk sistemlerinin avantajı, serbest bırakılan boncukların sıvı içinde yüzerek genetik materyali toplaması ve ellemeden dolayı kontaminasyondan daha bağımsız olmasıdır.
- 12:28PCR Metodları ve Çalışma Prensibi
- Retem PCR metodu kullanımı kolay ve hızlı sonuç vermesi nedeniyle tercih edilmektedir.
- PCR, PCL metodunun farklılaştırılmış halidir ve DNA'nın belirli bir bölgesini çoğaltmak için doğal replikasyon mekanizmasını kullanır.
- DNA çift sarmallı yapısını 95 derece ısıtma ile tek zincir formuna dönüştürerek, primer kullanarak kapanmasını engelleyip, tak polimeraz enzimi ile kopya oluşturma işlemi gerçekleştirilir.
- 14:01Konvansiyonel PCR ve Real-Time PCR
- Konvansiyonel PCR'de hedef bölgeyi görünebilir hale getirmek için işlem 35-50 kez tekrarlanır ve sonucu görmek için floresan ışıma gibi yöntemler kullanılır.
- Real-Time PCR, gerçek zamanlı olarak işlemi takip etmeyi sağlayan gelişmiş bir PCR tekniğidir.
- Real-Time PCR'de, primerin iki tarafında floresan ışıma yapan ve enerji soğuran moleküller bulunur; tak polimeraz enzimi primeri parçalarken floresan molekül serbest kalır ve ışıma verir.
- 17:04Diğer PCR Teknikleri ve Kullanım Sebepleri
- Sivrilizasyon boyası gibi diğer metotlar da kullanılabilir ancak gıdada çok tercih edilmez çünkü spesifik olmayıp validasyon parametrelerini kanıtlamak zordur.
- Erime eğrisi analizi, DNA'nın erime sıcaklığına göre boya serbest kalmasını kullanarak pozitif kontrolü doğrulamak için kullanılır.
- Real-Time PCR, performans ve yatırım maliyeti nedeniyle şu anda tercih edilen tekniğidir; dijital PCR ise standart kullanmadan kalibrasyon sağlayabilir ancak daha az yaygın kullanılmaktadır.
- 22:09DNA İzolasyonu ve Matriks Problemi
- Konuşmacı, DNA izolasyonunda kitap bilgisinin tam olarak uygulanamayacağını ve farklı metotlar kullanılması gerektiğini belirtiyor.
- Matriks problemi, organik materyal üzerinde yapılan işlemler sonrasında oluşan karmaşık yapıyı ifade ediyor.
- Gıda örneklerinde, başlangıçta canlı olan bir bitkinin (örneğin soya filizi) işlenmiş haline (soya resti) dönüşmesi sonucu DNA içeriği değişiyor.
- 24:23Örnek Değerlendirmesi ve İzolasyon Stratejileri
- DNA izolasyonu yaparken öncelikle elindeki materyalin ne kadar bitki DNA'sı içerebileceğini düşünmek gerekiyor.
- Standart metotlarda belirli kriterler (örneğin 200 miligramla başlama) sunulsa da, bu kriterler her zaman verimli sonuç vermiyor.
- Verimli sonuç elde etmek için miktarı artırma, inkübasyon süresini uzatma, protein miktarını artırma veya tekrar izolasyon yapma gibi esneklik göstermek gerekiyor.
- 26:41Analiz Sonuçlarının Yorumlanması
- DNA analizinde saflık, alan ve oran değerleri (260/280 ve 260/230) kullanılarak değerlendiriliyor.
- Kitap bilgisinde saf DNA'nın protein oranının 1.80 olması beklenirken, gıda örneklerinde 1.50 ile 2.00 arasında değerler kabul edilebilir.
- NanoDrop ölçümünde DNA miktarı yüksek görünse de, bitki analizinde yüksek CT değerleri alınabiliyor çünkü ölçümdeki DNA'nın tamamının bitki DNA'sı olduğu garantisi yok.
- 30:09Matriks Etkisinin Önemi
- DNA ölçümünde matriks etkisi önemli bir faktör olarak karşımıza çıkıyor.
- Gıda örneklerinde (örneğin kremalı bisküvi) bakteri ve biyofilm gibi farklı kaynaklardan gelen genetik materyal de ölçümde hesaba katılıyor.
- CRM (kaynak belirli materyal) örneklerinde bitki DNA'sı tamamı olduğu için dilüsyonlar kolayca yapılabilirken, gıda örneklerinde bu matematik tutmuyor.
- 31:19DNA Ölçümü ve Doğrulama
- Spektrofotometrede ölçülen DNA oranı tam olarak doğru olmayabilir, bu değeri doğrulamak için bitki spesifik PCR yapmanız gerekiyor.
- Evdeki DNA içeriğinin kökenini (bitki, bakteri, hayvansal) ve saflığını bilmiyorsunuz, bu nedenle nanodrop ölçümü sadece fikir veriyor.
- Bitki analizi artık zorunlu hale gelmiş, nanodrop'ta 800 ng DNA görüldüğünde "bitki analizi doğrudur" demek teknik olarak doğru olmuyor.
- 32:43CT Analizi ve Önemi
- CT analizi, real-time PCR'de farazidir ve eşik değeri belirler; bu çizgiyi geçerse inkar edilemez ışıma var demektir.
- Örneklerin başlangıç miktarı ne kadar yüksekse o kadar erken CT değerini verir, düşük miktarlı örnekler daha geç CT değerini verir.
- CT değerine bakarak bitki DNA'sının ne kadar olduğunu kaba olarak değerlendirebilirsiniz.
- 34:10DNA Miktarı ve Hassasiyet
- Bir nanogram DNA, yaklaşık 884,95 kopyaya tekabül ederken, hassasiyet limitleriniz 15-20 seviyelerinde olduğunda, bu miktar çok üstündedir.
- Bir nanogram DNA, 23-24 seviyede çok rahatlıkla tespit edilebilir, hassasiyet limitleriniz 15 kopya/1000'de 4 gibi yüksek seviyelerde olabilir.
- Reaksiyon verimini kontrol etmeniz gerekiyor, bu nedenle örneklerin verimliliğini eşitlemek için internet kontrol DNA'sı eklemek önemlidir.
- 36:01Internet Kontrol ve Verim Ölçümü
- Replikasyon çalışırken, tüm örneklere eşit miktarda internet kontrol DNA'sı eklenerek verimlilik karşılaştırması yapılır.
- Tüm örneklerde aynı CT değeri alınması beklenir, verimsiz bir örnek daha geç CT değerini verecektir.
- Evrel metotlarında internet kontrol mekanizması yoktur, bu nedenle verim analizini yapmanız gerekiyor.
- 38:12DNA İzolasyonu ve Sorunlar
- Aldığınız DNA örnekleri çoğunlukla kirli çıkıyor, özellikle yağlı veya katkı maddesi içeren şeylerde safsızlık ortaya çıkıyor.
- Yüksek verimlilik kullanarak analizde ek işlemler yaparak bu sorunları üstesinden gelebilirsiniz.
- Tepsipt limitinizi (hassasiyet limitinizi) yakalamak önemlidir.
- 39:06Örnek Türüne Göre Yaklaşım
- Yapacağınız iş her zaman aynı (DNA izolasyonu ve çoğaltma) olsa da, örnekler birbirine eşdeğer değildir.
- Yağ gibi örneklerde, 200 derece işlem geçirmiş ve fragmante DNA içeren ham yağda, DNA izolasyonu için özel yaklaşımlar gerekebilir.
- Jelatin gibi jelleşen örneklerde, polimerizasyon nedeniyle kolon tıkanabilir veya boncuklar birleşebilir, bu durumda miktarı azaltarak denge kurmak gerekebilir.
- 41:52DNA İzolasyonu Teknikleri
- Kolon tıkanmaması için 200 miligram tartıldığında, 100-102 tane örnek izole edilmeli ve polimerleşmemesi için uygun kıvamda tutulmalıdır.
- Jelleşme durumunda DNA çıkarılamaz, bu nedenle ilk hedef jelleşmeyi önlemektir.
- Likit materyallerde organik partikülün ayrılması ve çözünmeyen materyalin homojenizasyonu gereklidir.
- 42:40Materyal Türlerine Göre Yaklaşım
- Organik materyal içermeyen materyaller (bitki bazlı çamaşır suyu, duvar boyası gibi) karşılaşılabilecek durumlardır.
- Yağ ve süt numunelerinde genellikle 15 veya 50 mikrolitre balkonlarda işlem yapılır.
- Yüksek hacimden başlamak, maksimum organik materyal alınmasını sağlar.
- 44:11Kütle Bazlı İzolasyon
- İzolasyon sistemi belirli bir kütleyi izole eder ve sonunda bu kütlenin hacimine bölünmesiyle mikrolitredaki DNA miktarı hesaplanır.
- Düşük kütleye sahip numunelerde edisyon hacmini kontrol etme şansı vardır.
- Lifinden örnek alındığında 9-10 nanogram DNA üretildiğinde, yüksek hacimde aktarım yapıldığında kullanılabilir rakamlar elde edilmez.
- 45:39İzolasyon Stratejileri
- Jelatin numunelerinde yüksek rakamlar kabul edilir ve edisyon hacmi minimumda tutulmalıdır.
- Birden fazla izolasyon yapıp sonuçları birleştirerek konsantrasyonu artırabilirsiniz.
- Sıvının uçması sayesinde konsantrasyon artar ve daha az hacimle toplam izolasyonun tamamı aktarılabilir.
- 46:53İzolasyon Çalışmalarında Önemli Noktalar
- Elinizdeki örneğe göre uygun bir yaklaşım belirlemek gereklidir.
- Olabildiğince organik materyal kullanarak yüksek DNA miktarını PCR reaksiyonuna aktarmak hedeftir.
- Replikalı çalışırken sonuçların arasında verim korunması ve kontaminasyonsuzluk sağlanmalıdır.
- 47:46Kontaminasyon Kontrolü
- Laboratuvarlarda kontaminasyonun olmayacağı bir durum yoktur, önemli olan bunun nasıl kontrol edileceğini bilmektir.
- DNA yok eden DNA enzimleri laboratuvarlarda bulundurulmalı ve belirli aralıklarla DNaz enzimiyle temizlik yapılmalıdır.
- PCR ürün kontaminasyonu çıkarması zordur, bu nedenle önceden önlem alınmalıdır.
- 48:44Manyetik Boncuklu İzolasyon Tekniği
- Manyetik boncuklu yaklaşım, kolon sistemine göre daha özgür bir ortam sağlar ve modifikasyona açık kalır.
- Jelleşme durumunda anında müdahale edilebilir ve edisyon hacmi ayarlanabilir.
- Kullanılan enzimler klinik testlerde kullanılan enzimlerle aynı standartta olmalıdır.
- Yüksek verimli ve inhibisyona dirençli enzimler kullanıldığında daha az enzim inhibisyonu yaşanır ve daha az tekrar çalışmak gerekir.