Yapay zekadan makale özeti
- Kısa
- Ayrıntılı
- Bu video, bir uzman tarafından sunulan HPLC (High-Performance Liquid Chromatography) ve kromatografi teknikleri hakkında kapsamlı bir eğitim içeriğidir. Konuşmacı, enstrümantal analiz derslerinden tecrübelerini paylaşarak konuyu anlatmaktadır.
- Video, HPLC sisteminin çalışma prensipleri, kolaylık tanımları, adsorpsiyon ve absorpsiyon kavramları ile başlayıp, farklı kromatografi tekniklerini (ters faz, iyon değişim, boyut dışlama ve affinity kromatografi) detaylı şekilde ele almaktadır. Ayrıca kolon seçimi, mobil faz hazırlama, pH kontrolü ve kromatografi metotlarının optimizasyonu konuları da işlenmektedir.
- Video, eşdeğer kolon seçiminde dikkat edilmesi gereken parametreler, kolonların doğru kullanımı ve bakımı hakkında pratik bilgiler sunmaktadır. Laboratuvar teknisyenleri ve araştırmacılar için kolon tıkanması, pik şekillerindeki bozulmalar ve bunların çözümleri gibi önemli konular da ele alınmaktadır. Video, soru-cevap bölümleriyle interaktif bir yapıya sahiptir.
- 00:03HPLC ve Kolaylık Tanımları
- HPLC (High Performance Liquid Chromatography) sisteminde pompa, solventi sabit akışla kolona gönderen kalbi olarak adlandırılır.
- Adsorpsiyon, moleküllerin temas ettikleri yüzeydeki çekme kuvvetine bağlı olarak o yüzeyle birleşmesi; absorpsiyon ise bir maddenin başka bir maddenin yüzeyine bağlanmasıdır.
- Dipol momenti, pozitif ve negatif yük kutupları arasındaki elektriksel yüklerin uzaklıkların çarpılmasıyla elde edilen bağın kolaylığını gösteren bir ölçüdür.
- 01:18Polarlık ve HPLC Süreci
- HPLC'de özellikle ters kromatografide polarlık üzerine ayrım yapılır.
- Bağların polarlığı elektronegatiflikle alakalıdır; elektronegatifliği fazla olan atom, bağ yapımında kullanılan elektrodu kendisine çekerek molekülde kısmi kutuplaşma meydana getirir.
- HPLC'de numune ve standartlar enjekte edilir, kolonda ayrım gerçekleşir ve dedektöre farklı zamanda ulaşan pillerle kuantitatif analiz yapılır.
- 03:08Kolon Seçimi ve Ayrım Tekniği
- Kolon, HPLC sisteminde en önemli bileşendir; uygun kolon seçilmezse hiçbir zaman sonuç alınamaz.
- Ayrım tekniklerinde, kolon içindeki farklı kolaylıkta olan türler farklı tutunma yaparak dedektöre farklı zamanlarda ulaşır.
- Kolonun iç yapısı silikaların sıkıştırılmış halidir ve mobil faz, silika yüzeylerindeki uçlarla etkileşerek tutunma yapar.
- 05:10Pillere Simetri ve Ayrım
- En ideal pik simetrik piktir; üçgen şeklinde düşünüldüğünde tepe noktasından ikiye bölündüğünde A ve B alanlarının eşit olması gerekir.
- Fronting (önden kuyruklanma) ve tailing (arkadan kuyruklanma) durumları, analitik çalışmalarda A/B katsayısı 1,20-1,80 aralığında kabul edilebilir, 2'nin üstünde kabul edilmez.
- Fronting ve tailing durumları mobil faz uyumsuzluğu, pompanın düzgün çalışmaması, kolon başındaki çökmeler veya uygun kolon kullanılmaması gibi sebeplerle oluşabilir.
- 07:13Normal ve Ters Faz Kromatografisi
- Normal faz kromatografisinde sabit faz polar, mobil faz apolar olur; amino, siyano ve silika kolonlar kullanılır.
- Ters faz kromatografisi, en yaygın kullanılan yöntemdir; sabit faz apolar, mobil faz polar olur ve C18, C8, C4 gibi modifiye edilmiş gruplar kullanılır.
- Ters faz kromatografisi özellikle suda çözünen bileşikler için kullanılır ve mobil fazında tamponlarla beraber asetonit ve metanol kullanılır.
- 13:34Ters Faz Kromatografisi
- Ters faz kromatografisinde akış yönüne göre polar olan türler erken çıkarken, apolar olan türler apolar kolonda daha fazla zaman geçirir.
- Mobil fazın kolaylığı önemlidir ve dipol momenti katsayısı polarlığımızın bir ölçüsüdür.
- Su, metanol ve asetonit gibi mobil fazlar, çözüme ulaşamadığımız durumlarda sulu tamponlarla pH'ları değiştirerek ayrım yakalamaya çalışılır.
- 14:35İyon Değişim Kromatografisi
- İyon değişim kromatografisi su analizleri, ilaç, gıda ve et analizlerinde nitrit-nitrat gibi iyonik türlerin ayrımı için kullanılır.
- Bu teknikte kromatografi kolonu iyon değişim reçine yapısında olup, anyon-katyon değişimi gerçekleşerek iyonik türler ayırtılır.
- İyonik kolonlar özellikle C18 kolonu gibi tamponlarla yıkanmalı ve tamponlar içinde saklanmalıdır.
- 16:20Boyut Dışlama Kromatografisi
- Boyut dışlama kromatografisi farklı molekül boyutlarına sahip analitlerin ayrımı için kullanılır.
- Bu teknikte sabit faz genellikle polimerler, mobil faz ise toluen-TF tarzı organik solventler kullanılır.
- Kolonların gözenek büyüklüğü molekül direncine göre değişir; normal C18 kolonları 80-120 µm gözenek büyüklüğündeyken, boyut dışlama için 300 µm'den 3000 µm'e kadar farklı kolonlar kullanılabilir.
- 17:35Diğer Kromatografik Teknikler
- Affinity kromatografisi, elektro kromatografisi ve süperfluid kromatografisi (SFC) gibi teknikler de kullanılır.
- SFC, karbondioksiti süper kritik hale getirerek kolona göndererek ayrım sağlayan, doğaya sadece karbondioksit alarak maliyeti düşük ve kirliliği olmayan bir yeşil teknolojidir.
- HPLC kolonları sulu faz veya organik fazda çalışabilir, sulu faz kolonlarına organik, organik faz kolonlarına su bulaşmamalıdır.
- 19:18Kromatografik Hatalar ve Çözümler
- Mobil faz hazırlarken hacim azalması nedeniyle fazla solvent eklenmesi rezolüsyonu düşürür ve pikler birbirine girer.
- pH metrelerinin kalibrasyonlu olması ve taze hazırlanmış sodyum hidroksit ve asitli çözeltilerin kullanılması gereklidir.
- Kimyasalın skt'nin (son kullanma tarihi) kontrol edilmesi ve mobil faz hazırlarken çeşitli parametrelerin dikkate alınması önemlidir.
- 22:38Mobil Fazın Ayırma Gücü
- Gradient çalışma tek bir kromatogramda beş farklı pikin ayrılmak için kullanılabilir.
- Farklı asetonit oranlarında (100%, 60%, 30%, 20%) elde edilen kromatogramlarda, en iyi ayırma 20% asetonit oranında gerçekleşir.
- 25:07Optimum Çalışma ve Rezolüsyon
- En kısa sürede en hızlı işi yapmak önemlidir, rezolüsyon 2 olduğunda iki pik içinde değerlendirme yapılabilir.
- Optimum çalışma yapmak gerekir, çok uzun kolon seçip metodu uzatmanın bir anlamı yoktur.
- Rezolüsyon 1,5 ve üzeri idealdir, bu değerde iki pik için doğru ayrılmıştır ve miktar sonucu verebiliriz.
- 26:20Mobil Faz ve pH Kontrolü
- pH kontrolü ters kromatografide asidik-bazik yapıların ayrımında önemlidir.
- Klasik kolonlar genellikle pH 3-7 aralığında dayanır, ekstrem pH değerleri kolon ömrünü kısaltır.
- Mobil fazın pH'sını kontrol etmek gerekir, uygun olmayan pH'da kolon bozulabilir.
- 28:11Mobil Faz Hazırlama
- Mobil fazlar kesinlikle süzülmeli ve degazda bekletilmeli, özellikle tampon tuzları varsa.
- Taze hazırlanmış çözelti ile ayarlama yapmalı, kalibrasyonu yapılmış ametre kullanmalı ve düzgün karıştırmalıyız.
- 29:04Kolon Seçim Parametreleri
- Rezolüsyon, retention time'lar arasındaki farkın iki katının pik taban genişlikleri toplamına oranıdır.
- Alıkonma faktörü (k faktörü), retention time farkının mobil faz retention time'a oranıdır ve 2-5 arasında olmalıdır.
- Seçicilik faktörü kolonun yapısından (hidrojen bağlı grupları, dispersiyonu, polar/apolar olma) etkilenir.
- 34:30Teorik Plaka Sayısı ve Mobil Faz
- Teorik plaka sayısı kolonun verimliliğini gösterir, azaldığında kolonun yıprandığını veya mobil fazın yanlış hazırlanmış olduğunu gösterir.
- Mobil faz, kolonun ayırma gücünü etkiler, dipol momentine göre kolaylık sırası su > metanol > aseton > nitrit şeklindedir.
- Ters fazda genellikle metanol-resetonitli su karışımları ve tamponlar kullanılır.
- 36:41Kolon Seçim Parametreleri
- Kolon seçiminde kolonun tanımı ve spesifikasyonlarına bakmak gerekir; örneğin L1, L7, L63, L80 gibi USB ligand kodları ve C18, C8, amin, silika gibi farklı türler mevcuttur.
- Kolon spesifikasyonları arasında demirin dış çapı (250 milim), uzunluğu (5 mikron), silikanın partikül çapı (300) ve gözenek büyüklüğü (C18 kolonları genellikle 80-120 arasında değişir) bulunmaktadır.
- Gözenek büyüklüğü önemli bir parametredir; 80 olan bir kolonun yerine 100 kullanıldığında büyük farklar düşünülmezken, 60 olan yerine 120 kolon kullanıldığında pittaki değişimi fark edilebilir.
- 38:04Sabit Fazlar ve Polarlık Sırası
- Sabit fazlar için polarlık sırası C18 (en apolar) dan silika (en polar) e doğru iner; amin, C8, C4 sıralaması apolarlıktan polarlığa doğru gider.
- Kolonların eşdeğer seçiminde silikanın ucuna bağlanan grupların özelliklerine dikkat edilmelidir.
- Kolon seçiminde USB ligand kodu, silika tipi, gözenek büyüklüğü, yüzey alanı ve karbon yükü gibi parametreler önemlidir.
- 40:05Eşdeğer Kolon Seçiminde Önemli Parametreler
- Eşdeğer kolon seçerken silika tipinin aynı olması önemlidir; klasik silika, tip A, tip B veya polimerk silika olabilir.
- Gözenek büyüklüklerinin birbirine yakın olması gerekir; 100 olan yerine 80 veya 120 kullanıldığında büyük farklar olmaz, ancak 60 veya 200-300'e çıktığınızda etkili olabilir.
- İzolitik çalışmalar için yüzey alanı ve karbon yükü birbirini egale eden etmenlerdir; yüzey alanı düşükse karbon yükü yüksek tutulmalıdır.
- 43:21Eşdeğer Kolon Kullanımı
- İzolitik çalışmalar için eşdeğer kolon kullanılabilirken, gradient ve hassas çalışmalarda (imprite çalışmalarında) eşdeğer kolon kullanmak mantıklı değildir.
- Klasik analizlerde (tahinli solüsyon, gıda analizleri) eşdeğer kolon kullanılabilir, en fazla 2-3 piksel fark olabilir.
- Eşdeğer kolon seçerken aynı silika tipi, gözenek büyüklüğü, yüzey alanı ve karbon yükü gibi parametrelerin aynı olması önemlidir.
- 44:49Ek Önemli Noktalar
- Kolonların pH direnci ve sıcaklık toleransına dikkat edilmelidir; klasik kolonlar genellikle 45 derecenin üstüne çıkmayı sevmezken, polimer kolonlar 80 derecelere kadar çıkabilir.
- İçindeki silikanın saflık derecesi ve metal yoğunluğu da önemli parametrelerdir, özellikle yeni moleküller çalışırken metal yoğunluğu etkili olmaya başlamıştır.
- 46:37Kolon Yıkama Hataları
- En sık yapılan hatalardan biri her kolona aynı yıkama yönteminin uygulanmasıdır.
- Kolonların kullanım kılavuzları internetten indirilebilir ve her kolonun farklı yıkama çözeltisi vardır.
- Eski nesil kolonlar genellikle metanol, yeni nesil polimerik kolonlar ise aseton ile yıkamayı tercih eder.
- 48:32Doğru Yıkama Yöntemleri
- İyon kolonları iyon çözeltisi ile, tamponlu kolonlar tamponlu çözelti ile yıkanmalıdır.
- Organik fazlı kolonlara su bulaşmamalı, su fazlı kolonlara ise organik çözelti uygulanmalıdır.
- Yıkama yaparken önce %15-20 asetonitli veya metanollu çözelti ile en az 10-15 kolon hacmi akıtılmalı.
- 50:16Kolon Sorunları ve Çözümleri
- Kolon problemleri pik şekillerinde bozulma, hasarlı kolon, yanlış pH ve aşırı enjeksiyon hacmi gibi nedenlerle oluşabilir.
- Kolon başındaki çökme durumunda, aynı kolonun silikasından malzeme alınıp dolgu yapılabilir ancak bu çok tavsiye edilmez.
- Kolon tıkanması durumunda fritler ultrasonikte temizlenerek geri takılabilir.
- 52:08Kolon Bağlantı Hataları
- Kolonların bağlantı hataları ölü hacim oluşturabilir ve tali pikler oluşmasına neden olabilir.
- Kolon bağlantılarında tüpün ucunun kolonun dik noktasına değdiği emin olunmalıdır.
- Tüpün ucunun kesilmesi veya yamuk kesilmesi yayılma etkisine neden olabilir.
- 54:29Kolon Kullanım Yönlendirmesi
- Kolonlar normalde akış yönünde bağlanmalıdır, performansı düştükten sonra tersten kullanılabilir.
- Özel olarak amin ve karbonhidrat kolonları (7,80 x 300) 4-5 litre fazla tersten kullanılabilir.
- Kolon çapında tıkanma durumunda tersten yıkama yapılmalı ve dedektöre bağlanmamalıdır.