Yapay zekadan makale özeti
- Kısa
- Ayrıntılı
- Bu video, bir konuşmacı tarafından sunulan HPLC (High-Performance Liquid Chromatography) sistemlerinin bakım ve kullanımı hakkında kapsamlı bir eğitim içeriğidir. Konuşmacı, laboratuvar teknisyenleri ve HPLC sistemlerini kullanan diğer uzmanlar için hazırlanmış bu eğitimde teknik detayları paylaşmaktadır.
- Video, HPLC sistemlerinin temizliği, kolon takma, sistem şartlama, tüming kesimi ve kolon bakım gibi konuları sistematik bir şekilde ele almaktadır. İçerikte normal faz ve ters faz sistemleri arasındaki geçişler, solventlerin karıştırılması, kolonların doğru takılması, ölü hacim sorunları ve çözümleri, kolon rejenerasyonu ve saklama teknikleri gibi önemli konular detaylı olarak anlatılmaktadır.
- Eğitim, HPLC sistemlerinde karşılaşılabilecek teknik sorunları tespit etme ve çözme yöntemlerini içermektedir. Ayrıca, paslanmaz çelik ve plastik fittinglerin kullanım alanları, sıkma teknikleri, solvent filtrelerinin kontrolü ve dedektörlerin doğru kullanımı gibi pratik bilgiler de sunulmaktadır. Video, laboratuvar personelinin HPLC sistemlerini daha etkili ve verimli kullanabilmeleri için gerekli teknik bilgileri içermektedir.
- 00:01HPL Sistemlerinde Normal ve Ters Faz Kromatografi
- HPL sistemlerinde normal faz kromatografisinde egzan, epton gibi suyla karışmayan polar çözücüler kullanılırken, ters faz sistemlerinde su, metanol ve tampon gibi suda iyi çözülen polar çözücüler tercih edilir.
- Sistemler arasında geçiş yaparken, su ve egzan gibi çözücüler arasında doğrudan geçiş yapılamaz, iki propol üzerinden geçiş yapılmalıdır.
- Tampon çözeltisi ile su ve organik solvent arasında doğrudan geçiş yapılamaz, bunun yerine tampon çözeltiden suya, sudan organik solvente geçiş sağlanmalıdır.
- 02:27Sistem Temizliği ve Hazırlık
- Sistem değişikliği yaparken önceki analizden kalan tüm solventler uygun şekilde ortamdan uzaklaştırılmalı ve tüm hatlar uygun yıkama solüsyonlarıyla temizlenmelidir.
- Bir önceki analizden kalan tüm solüsyonlar, etiketli veya etiketsiz, son kullanma tarihi uygun olup olmamasına bakılmaksızın solvent rezervuar alanından uzaklaştırılmalıdır.
- Çözücülerin karışabilirliği tablosuna dikkat edilmeli ve birbiriyle karışmayan iki solventin HPL sisteminde karşılaşması önlenebilir.
- 04:40Sistem Temizliğinde Dikkat Edilmesi Gerekenler
- Sistem temizliği aşamasında kolonun sistemden çıkarılması ve temizlik sırasında sistem üzerinde kalması istenmemelidir.
- Uygun yıkama solüsyonlarının sisteme takılması ve yeterli miktarda solüsyonun olması gerekmektedir.
- Sistemde hava varsa, temizleme işlemine başlamadan önce bu havanın ortamdan uzaklaştırılması gerekir.
- 06:07Solvent Rezervuar Alanı ve Kolon Bağlantıları
- Solvent rezervuar alanında hareketli faz filtreleri kesinlikle bulunmalıdır, bu filtreler sistem güvenliği ve analiz güvenliği için önemlidir.
- Solvent rezervuar alanında uygun kapaklar kullanılmalı, parafinle kapatılan şişeler kullanılmamalıdır çünkü parafinler organik solventlerle çözünerek sistem kontamine edebilir.
- Ara bağlantı (union) parçaları, iki parçayı birbirine bağlamak için kullanılan delikli parçalardır ve vidalarla sıkıştırılarak kullanılır.
- 08:34Ara Bağlantıların Doğru Kullanımı
- Ara bağlantılar ceblerde dolaşmamalı, çünkü içerisinde kirlilik veya kontaminasyon kalabilir ve bu sistemde problemlere neden olabilir.
- Ara bağlantılar uygun şekilde saklanmalı ve kullanılmalıdır, aksi takdirde tübinglerin tıkanması veya dedektörlerin sorun yaşaması gibi problemler yaşanabilir.
- Sistem temizliğinde önceki analizden kalan kalıntıları uzaklaştırmak için pearch işlemi gerçekleştirilir ve bu işlem sırasında ara bağlantılar kullanılmaz, dedektörle bağlantı verilmez ve kolon sisteme takılmaz.
- 11:28Hareketli Fazın Doğru Kullanımı
- Hareketli fazı su ve asit çözeltisine daldırırken, filtrelerin ve tümiklerin içinde kalan su mobil fazına karışabilir ve bileşimi değiştirerek analiz hatası yapabilir.
- Hareketli fazın 50-100 ml'sinden bir kısmını ayrı bir beheri alıp önce ps edip doyurulmalı, böylece hatayı minimize edilir.
- Sistem şartlarken önce temizlenir, hareketli faz uygun şekilde takılır ve ara bağlantı doğru takılmalıdır.
- 13:42Sistem Temizliği ve Tuz Sorunu
- HPLC sistemlerinde en büyük düşman tuzdur, tampon çözeltilerindeki tuz asetonit ve metanol gibi organik solventlerle iyi geçinemez.
- Tampon çalışmalarında sistemi önce %100 suyla yıkamak ve ardından organik solüsyonlar geçirmek gerekir.
- Sistemi %100 asetonit ile yıkadıktan sonra tampon içeren hareketli faz takılıyorsa, tekrar %100 suyla yıkamak gerekir.
- 16:20Kolon Takımı ve Sistem Şartlanması
- Kolon takarken önce akış durdurulmalı ve kolon doğru yönde takılmalıdır.
- Kolon şartlama işlemi ile dedektör şartlama işlemi beraber yapılabilir.
- Paslanmaz çelik nutfeler ve plastik somun fittingler farklı sistemlerde kullanılır; plastik somunlar 500 psi'a kadar basınç için, paslanmaz çelikler 5000 psi'dan yukarısı için uygundur.
- 19:47Fittinglerin Önemi
- HPLC sistemindeki pre-analitik hataların çoğu kolonların doğru takılmamasından kaynaklanır.
- Fittinglerin doğru takılması piklerin şekilleriyle yakından ilişkilidir ve yanlış takma sistemde çeşitli problemlere sebep olabilir.
- Plastik fittingler elle sıkılabilecek tek parça halindeyken, metal fittinglerde vida ve ferrür ayrıdır ve sıkıldıktan sonra tüpten çıkartılamaz.
- 21:08HPLC Sistemlerinde Kolon Bağlantı Sorunları
- HPLC sistemlerinde kolon takma işleminde X uzunluğu çok uzun veya çok kısa bırakıldığında sistemsel kaçaklar ve problemlere sebep olur.
- Uzun takma durumunda lig (kolondan ve ferrden, ferrin arkasındaki nottan ve tüm sistem arasındaki boşluktan) kaçak meydana gelir.
- Kısa takma durumunda kolonla tübing arasında oluşan ölü hacim (ara boşluk) kromatogramda çeşitli problemlere yol açar.
- 22:22Doğru Takma İşlemi ve Sorunlar
- Doğru takma işlemi, kolonla tubing arasında ne uzun ne kısa, tamamen uyumlu bir bağlantı sağlamaktır.
- Takma ölçüler kolon ve tubing üreticilerine göre değişebilir, marka ve modeline uygun parçalar kullanılmalıdır.
- HPLC sistemlerinde genellikle kısa takma problemiyle karşılaşılmaktadır.
- 23:22Uzun Takma Durumundaki Sorunlar
- Uzun takma durumunda pikler beklenen şekilde gelir ancak yüksek alıkonma zamanı, değişken sinyal yoğunluğu ve base line'da gürültü görülür.
- Sistemde kaçaklar meydana gelir, hareketli faz kolondan kaçmaya başlar.
- Basınç kayıpları oluşur ve sistemdelik (kaçak) oluşur.
- 24:04Kısa Takma Durumundaki Sorunlar
- Kısa takma durumunda zayıf pik şekli ve düşük rezolüsyon meydana gelir.
- Bu durumda kolon performansı düştüğü düşünülerek yeni kolon açılarak kolon ömrü kısaltılabilir.
- Basınç seviyeleri beklenen durumda olur çünkü kaçak yoktur, ancak alıkonma zamanlarında değişiklik olmaz.
- 26:56Uygun Bağlantı ve Sorun Tanımlama
- Uygun bağlantı yapıldığında tüm parametreler (pik şekilleri, alıkonma zamanları, sinyal yoğunluğu ve basınç) beklenen aralıkta çıkar.
- Uygun bağlantı yapılmadığında sıvı damlamaları, kaçaklar, basınç varlıkta akış yokluğu gibi sorunlar görülür.
- Sistemde basınç var ancak kolondan akış geçmiyorsa, kolon fırını açılmadan saatlerce çalışmakta olan sistemde çözeltiler birikir.
- 28:36Kromatogramdaki Etkiler ve Sorun Giderme
- Kolon bağlantı sorunları nedeniyle piklerde yayvanlaşma, omuz verme ve çatallaşma gibi bozulmalar görülebilir.
- Kaçak varsa sistemde önce akış durdurulmalı, tubinglerin doğru takılıp takılmadığı ve notların yeterince sıkıştırılıp sıkıştırılmadığı kontrol edilmelidir.
- Sisteme uygunsuz parçalar kullanıldığında sorunlar yaşanabilir, doğru üreticinin tavsiye ettiği parçalar kullanılmalıdır.
- 31:29Tüminglerin Kesilmesi ve Etkileri
- Tüminglerin doksan derecelik ve dik bir açıyla kesilmesi gerekiyor, hiçbir şekilde yan kesilmemeli.
- Yan kesildiğinde ölü hacim oluşur, bu da düşük rezervasyon, düşük sinyal yoğunluğu ve beklenen ölçüde basınç sorunlarına neden olur.
- Yan kesilme durumunda piklerde kuyruklanma (tailing) meydana gelir ve bu durumda sisteme uygunluk parametreleri geçemeyebilir.
- 33:09HPLC Sisteminin Hazırlanması
- HPLC sistemini analiz hazırlarken tübiklerin doğru kesilip kesilmediği, kaçak olup olmadığı ve ölü hacim oluşturup oluşturmadığı kontrol edilmelidir.
- HPLC sistemlerinde yüzlerce farklı hata ihtimali bulunur, ancak öncelik sıralaması iyi belirlendiğinde hata oranları azalır.
- Sistemde problem çıktığında, hata ihtimali azaldıkça doğru hatayı bulma ve çözüme ulaşma ihtimali artar.
- 36:22Bekleme Hacmi ve Sistem Hacmi
- Bekleme hacmi (diver volume) ve sistem ölü hacmi (system dead volume) iki farklı terimdir ve genellikle karıştırılır.
- Bekleme hacmi, karıştırma ünitesi ile kolon girişi arasındaki HPLC sisteminin hacmidir ve gradient çalışmalarda önemlidir.
- Sistem ölü hacmi, HPLC sisteminin enjeksiyon noktası ile tespit noktası arasındaki kolon hariç hacmidir.
- 39:27Sistem Hacminin Önemi
- Düşük basınçlı gradyan sistemlerinde her hareketli faz için ayrı pompa kullanılmaz, porsiyonlama valfi kullanılır.
- Yüksek basınçlı gradyan sistemlerinde her hareketli faz hattı için ayrı bir pompa sistemi vardır.
- Sistem hacmi düşük olan sistemlerde (yüksek basınçlı gradyan sistemlerinde) daha iyi ayrım, daha yüksek hassasiyet ve daha tekrarlanabilir sonuçlar elde edilir.
- 43:30Silika Bazlı HPS Kolonlarının Özellikleri ve Kullanım Parametreleri
- Silika bazlı HPS kolonları geniş bir mekanik stabiliteye ve mükemmel fizikokimyasal yüzey özelliklerine sahiptir.
- Günümüz teknolojisi sayesinde silikalar çeşitli şekillerde modifiye edilerek farklı kullanım alanlarında sunulmaktadır.
- Kolonları kullanırken dikkat edilmesi gereken parametreler: pH stabilitesi, mekanik dayanım, hareketli faz kullanım koşulları, yıkama ve saklama koşulları, dengeleme süreleri.
- 44:12pH Stabilitesi
- Kromatolojik kolonların uygun kullanılabileceği pH aralıkları kolon kullanım manuellerinde bulunur.
- Silika modifiye silikalarda genellikle 2 ila 8 arasında pH çalışma aralığı verilir, ideal çalışma aralığı 2-8 arasındadır.
- pH ayarlama işlemi daima organik solventleri karıştırmadan önce yapılmalıdır.
- 45:06Mekanik Dayanım
- HPC kolonları 6000 psi basınca kadar kullanılabilmektedir.
- Silikalar sabit fazlarda mekanik olarak kararlı bileşiklerdir ve stres koşullarına (pH ve basınç aralıklarının dışına çıkması) tabi tutulmadığında uzun ömürlü olarak kullanılabilmektedir.
- Sistemde ani basınç artışlarına karşı önlem alınmalıdır, basınç yavaş yavaş artırılarak kolonun basınç kuvvetiyle karşılaşması engellenmelidir.
- 46:44Hareketli Faz Kullanımı
- Hareketli faz uygun yaş aralığında olmalı ve kesinlikle filtre edilmelidir.
- Kromatografik kolonlar filtre mantığıyla çalışır ve hareketli fazla uyumlu olmayan partikülleri tutabilir, bu durum hayalet pikler şeklinde görünür ve sonuçları etkileyebilir.
- Tüm çözeltiler HPLC grade olmalı, saflığı HPLC'ye uygun olmalı ve uygun ultra saf su kullanılmalıdır.
- 48:24Yıkama ve Saklama Koşulları
- Kısa süreli saklama için (gece boyu) kolon cihaz üzerinde takılı şekilde mobil fazla bırakılabilir.
- Uzun süreli saklama için kolonlar önce %90 su oranında yıkandıktan sonra %90 su %10 organik oranında kısa vadede saklanabilir.
- Kolonlar %50'den aşağı su oranında saklanmamalı, uzun vadede %100 asetonit ile saklanmalıdır.
- 50:33Tampon Çözeltileri ve Sistem Bakımı
- HPLC sistemlerinin düşmanı tampon çözeltileridir, yanlış uygulandığında sistemi mahvedebilir.
- Tampon çözeltileri organik solventlerle iyi geçinmez, bu nedenle tamponlar uzaklaştırıldıktan sonra %100 asetonit kullanılabilmelidir.
- Ters baz kolonlar %100 suda yıkanmamalıdır, bu silika yapılarını kırıp kolon performansını bozabilir.
- 53:20HPLC Kolonlarının Şartlanması ve Depolanması
- Kolonlar şartlanırken genellikle on veya yirmi kolon hacmi geçirmek yeterlidir.
- Uzun süreli depolama için kolonlar HPLC sisteminde bırakılabilir veya özel kolon tapalarıyla kapatılarak depolama alanına kaldırılabilir.
- Kolonların uçları alüminyum folyo veya parafilmle kapatılmamalı, özel tıpalar kullanılmalıdır, aksi takdirde kontaminasyon veya silika ayakların kuruması gibi sorunlar yaşanabilir.
- 55:37Dengeleme Süresinin Hesaplanması
- Dengeleme süresi hesaplanırken kolon hacmi, bekleme hacmi ve akış hızı dikkate alınır.
- Örnek hesaplamada 250x4,6 mm'lik bir kolon için 26 dakikalık bir dengeleme süresi bulunmuştur.
- Kolonların çok uzun süre şartlanması maliyet artışı, analiz gecikmesi ve efor kaybına neden olabilir.
- 58:39Kolon Takibi ve Sıfır Kolonun Açılması
- Kolon takip çizelgelerinde iç hacim gibi önemli parametrelerin ve şartlama sürelerinin belirtilmesi standartlaştırma açısından önemlidir.
- Sıfır kolonlar genellikle %60-80 metanol-su karışımlarıyla test edilerek gönderilir ve direkt mobil fazla açılabilir.
- Kolon kutularının içine veya üretici sitelerinde hangi mobil faz kullanıldığı bilgisi yer alır, bu bilgiye göre tampon oranı dikkate alınmalıdır.
- 1:01:21Kolon Açma ve Rejenerasyon
- Kolon açma işlemlerinde düşük akışlardan başlayıp gradyan bir şekilde normal çalışma akışına geçilmelidir, basıncı aniden yükseltmek zararlıdır.
- Kolon rejenerasyonu için protokoller kolon kullanım dökümanlarında bulunur ve üretici tarafından sağlanır.
- Rejenerasyon işlemleri genellikle başarılı değildir, başlangıçta analizi kurtarabilir ancak daha sonra performansı bozabilir.
- 1:03:30Rejenerasyonun Maliyeti ve Avantajları
- Kolon rejenerasyonu maliyetli olabilir ve kolonun performansını tam olarak geri getirmeyebilir.
- Tek enjeksiyon maliyeti hesaplanmalı, rejenerasyon maliyeti ile karşılaştırılmalıdır.
- Rejenerasyon maliyeti kolonun tamamen yeni bir kolonla değiştirilmesinden daha fazla ise, kolonun hurdaya ayrılması daha mantıklıdır.
- 1:04:45HPLC Sistemlerinde Dikkat Edilmesi Gerekenler
- Organik solventler her iki günde bir kontrol edilmeli ve yıkama çözeltileri iki günden fazla kullanılmamalıdır.
- Tüm çözeltiler taze hazırlanmalı, özellikle yıkama solüsyonları ve mobil fazlar.
- Mobil fazlar takarken 5 dakika boyunca 2,5-3 ml/min akışta taze solventle hatlar temizlenmelidir.
- 1:06:40Sistem Şartlama ve Bakım
- Solvent filtreleri kir ve tıkanıklık açısından düzenli olarak kontrol edilmelidir.
- Filtreler tıkandığında sistemde hava kabarcıkları, basınç kayıpları ve alıkonma zamanlarında kaymalar oluşabilir.
- Sisteme takıldıktan sonra 2-3 dakika boyunca hareketli fazlar perch edilmelidir.
- 1:08:37Dedektör Şartlama ve Bakımı
- Dedektörler genellikle kolon yıkama ve sistem şartlama sırasında açılmamalıdır.
- Lamba analizden en az bir saat önce açılmalı ve dedektör çevre ortam sıcaklığı sabit tutulmalıdır.
- Dedektörler havalandırma filtrelerinden uzak tutulmalı ve atık hatlarının doğru yerleştirildiğinden emin olunmalıdır.
- 1:10:40Sistem Kapatma ve Bakım
- Uzun süre kullanılmayacak sistemler yüksek organik içerikli bir solüsyonda bırakılmalıdır.
- Bakteri üremesi ve yosunlaşma sebebiyle hatların tıkanması önlemek için organik oranı yüksek çözeltide sistemler tutulmalıdır.