The Binding of Isaac oyununun hikayesi, İncil'deki İshak'ın bağlanması olayından ilham almıştır .
Oyunun başında, Isaac'in annesi Tanrı'dan bir mesaj alır ve bu mesajda oğlunun günahlardan arındırılması için kurban edilmesi gerektiği söylenir . İshak, annesinin kendisinden vazgeçeceğinden korkarak evin altındaki canavar dolu bodrum katına kaçar .
Oyunda oyuncu, Isaac veya diğer altı oynanabilir karakterden birini kontrol ederek bodrum katındaki zindanlarda ilerler . Yolda canavarları yenerek, item ve güç-up'ları toplayarak annesiyle nihai yüzleşmeye ve diğer boss'ları yenmeye çalışır .
Oyunun sonunda, Isaac'in annesinin kalbi ile savaşması gereken sekizinci kata ulaşılır . Ayrıca, isteğe bağlı dokuzuncu kat olan Sheol'da, son boss olarak Satan ile karşılaşılabilir .