Spider-Man 3 filmi, Peter Parker'ın süper kahraman kimliği Spider-Man ile özel hayatı arasındaki dengeyi kurmaya çalışmasını anlatıyor. Filmin konusu özetle şu şekilde: Bir yıl önce yaşanan olayların ardından Peter, Mary Jane Watson ile geleceğini planlarken, aynı zamanda amcası Ben'in gerçek katili olan ve bir kaza sonucu vücudunu kumla birleştiren Flint Marko ile de mücadele etmek zorunda kalır. Ayrıca, Peter'ın eski en iyi arkadaşı Harry Osborn, babasının ölümünden Spider-Man'i sorumlu tutarak intikam peşine düşer ve Daily Bugle'daki işi, rakip fotoğrafçı Eddie Brock'un ortaya çıkmasıyla tehlikeye girer. Bu sırada, Peter'ın giysisine bağlanan yabancı bir simbiyot, güçlerini artırırken aynı zamanda saldırganlığını ve diğer olumsuz özelliklerini de ortaya çıkarır.